实验技术
超高分辨率成像要求
发布时间:2019年11月01日   作者:维护管理员    阅读次数:148

STED超高分辨成像原理:利用损耗激光形成的光环包围和损耗掉埃利斑周围的衍射部分,只剩下中心点,实现分辨率的提升。

荧光标记选择:尽量使用短发射带宽的荧光蛋白(如GFP、mcherry)或Alexa Fluo系列的荧光标记。在需要多色荧光成像时采用序列扫描程序,但因同时存在多种荧光标记,其中不允许使用DAPI、Hoechst等发射带宽大的染料。染核可改用picogreen

荧光信号要求:尽可能强和稳定,可同时配合抗淬灭剂。

物镜选择:只能使用STED专用的100x油镜和93x甘油镜,并使用70%以上甘油介质封片。低倍常规物镜无法做超高分辨率成像。

光源选择:必须使用脉冲光源,如白激光。

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以AF488染料为例,可使用498nm激发,接收范围采用508-580nm,损耗光选择660nm


超高分辨率成像,需要在目标荧光标记的发射峰的尾端安排损耗激光。

激发光的波长尽量接近最大发射峰(本机激发光源采用白激光,波长可调谐)

荧光接收范围,起始波长为激发波长+10nm

提高超高分辨率成像分辨能力的渐进措施:

1、使用HyD检测器

2、使用门控成像

3、使用775nm脉冲损耗光成像

4、启用惠更斯软件逆卷积处理以进一步提高分辨率

本机的极限分辨率约41nm。