为什么使用激光共聚焦显微镜

用来在x-y-z-t-λ五维空间内观察和拍摄组织或细胞内部某种结构或分子的荧光信号强度、分布范围、活动动态等。

什么样品可以使用激光共聚焦显微镜观察

必须是带有荧光标记的材料，如荧光染料、荧光抗体、荧光蛋白转基因材料。

可见光染色的材料如HE染色的切片，可以通过目镜观察到，但是无法获得彩色图片，也无法实现三维成像。

若需要拍摄非荧光染色的彩色图像，需使用装有彩色CCD相机的普通显微镜，本实验室微流控活细胞实时分析系统的显微镜部分具有这种彩色成像拍摄功能。

应该选用哪台显微镜

建议大家选择正确的机型进行实验，比如植物和微生物转基因材料的鉴定还是首推710。经过前期实验确认荧光信号正确表达的，可以使用FV3000快速顺畅地获取图像。

正置710型：

植物和微生物转基因鉴定首选本机。适合大多数载玻片装载的样品，可用于转基因材料筛选。

利用该机的长通（Long Pass）荧光滤片可以目视鉴别疑似转基因株系，配合34通道光谱检测器则可以快速鉴定真假转基因信号。该机还配有具备高数值孔径的25x水浸物镜，在中等放大率下具有优秀的成像分辨率。

该机操作简便，但因长期服役扫描装置老化，长时间成像时图像有抖动，z轴操纵不畅。

倒置FV3000：

便捷拍摄和大面积自动拼接成像首选本机。适合薄底培养皿、多孔板、细胞瓶装载的样品，兼容部分载玻片装载的细胞爬片样品。可以通过鼠标控制标本自由移动和调焦，并可作大幅面多视野自动拼接成像。

倒置leica sp8：

该机具备接近电子显微镜分辨率的超高分辨率荧光成像功能，也可做普通共聚焦扫描。

该机也具备长通滤片，方便进行目视转基因株系筛选。该机具备Light Gate荧光寿命检测器，有助于滤除自发荧光。该机装备可调谐的白激光器，不仅具有荧光光谱扫描能力，还可以扫描激发光谱。其他功能与FV3000相似。该机需要由管理员在场指导。

高内涵分析系统：

该机主要用于自动化拍摄和分析贴壁培养细胞样品中细胞和细胞器的数量、信号强度等信息，并形成统计图表。要求使用细胞成像板装载样品，适合不同处理的细胞样品的批量检测和自动化分析。但因没有目镜，无法目视搜寻视野，针对个别个体的成像操作极为不便。该机主要用于有较多样品需要统计细胞特征的情形，比如死活细胞计数、细胞自噬分析等等，可以节约大量图像拍摄和图像分析的时间。

预约时需要提供哪些信息

材料类型：植物？细胞？胚胎？斑马鱼？

一共使用了哪几个荧光标记：常用的填写荧光基团或荧光蛋白名称，自己合成的提供荧光光谱图

使用的容器：载玻片？细胞爬片？平皿？细胞板？

样品的数目：几个转基因材料株系，或者几个不同浓度的处理

样品制备时有哪些要求

常规的薄切片应使用标准载玻片承载，并用厚度不超过0.18mm的盖玻片覆盖。盖玻片尽量使用预洗型的洁净低荧光玻片。

较厚的材料如叶片、植物根、线虫等应分割成小块或分隔开单个个体，，并以至少3个个体品字形布置在盖玻片下面，以维持盖玻片水平（3点决定一个平面）。

特别厚的材料如胚胎、卵等应采用等厚的凝胶块等辅助支撑或在粘性介质（如phytagel或较高粘度的甘油溶液）的浸泡下用水镜免盖玻片观察，水镜只能使用710型正置共聚焦。

具体参看https://clsep.zju.edu.cn/Portals/News/Read/2055

特殊拍摄需求

未使用过z-stack三维成像、time-series时间序列成像、多视野自动拼接成像、胞内PH测定、Fret、光漂白等高级功能者，预约时请在备注栏加注，以便管理员做好培训准备，欢迎通过邮件与仪器管理员交流具体方案。

需要做活细胞实验的，除备注栏加注信息外，可能需要面见管理员咨询控温、控湿和二氧化碳供气条件等是否具备。

开机和关机

由管理员执行，特殊情况在管理员指导和委托下，用户可根据墙面说明执行。

数据拷贝

在文件服务器上插入U盘，从相应显微镜主控计算机的共享目录下拷贝。

数据处理

拷贝数据后通过Zen2009、FV31S-DT等专用软件或免费的专业软件FiJi/ImageJ进行。

禁止事项

共聚焦显微镜有严格的开启程序和运行计划，未经授权和未经预约的情况下禁止随意触动系统各组件的电源按钮，禁止随意重启主控软件和计算机。

没有经过管理员亲自培训的用户禁止独立操作。

没有培训过的工作模式禁止擅自尝试。比如仅做过普通多通道成像，不要擅自做z-stack。

显微镜气浮减震平台和电器设备上禁止放置任何物品，包括液体、手套、移液器和实验记录本等。

禁止在显微镜室饮食、聊天、播放音乐。

禁止携带除切片和平皿以外的大型物品进入显微镜室，如整盆带土的苗、超过100ml的水、活体小鼠、昆虫等，此类物品若确有需要，请在实验准备区进行预处理。