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710分析烟草、原生质体等材料,无荧光照明时的操作流程
发布时间:2021年03月11日   作者:Confocal-Admin    阅读次数:786

因710的荧光光源待修,目镜下寻找目标细胞不易。以下是以GFP为例的操作流程,供参考。

1、目镜下使用明场照明,寻找细胞或合适的视野,然后更改物镜为拍摄用的25x(烟草等)或63x(原生质体、菌丝等),调好焦距。

2、电脑端使用lambda模式,选择激发光488nm,power=100%,gain=850,pinhole=150-250,选定主分光镜为MBS488,检测带宽为500-630nm

3、开始预扫描,同时手动微调焦距使目标细胞影像达到最亮最清晰,停止预扫描

4、观察细胞影像颜色为绿偏蓝即可判断为GFP阳性细胞。若无法判断,可进入unmixing界面,仅对怀疑阳性且信号最亮的像素区域进行精确套圈,观察光谱曲线,GFP的特征是:最高主峰出现在510-525nm处,次主峰出现在540nm处。理想情况下次主峰高度约为主峰的一半,若次主峰高度超过主峰,判断为假阳性。自发荧光的特征是主峰出现在550-560nm处,颜色显示为偏黄的绿色或黄色,属于假阳性细胞。

5、若分析显示细胞为阳性,切换到Channel模式正式拍摄。若判断为假阳性,切回目镜,重新寻找视野。

6、若阳性率极低,可以采用实时扫描模式:使用lambda模式并进入预扫描状态,左手调焦,右手缓缓移动载物台,眼睛观察屏幕。若发现有绿色点掠过,即可能为阳性细胞。


注意:lambda模式仅用于判断,得到的文件不需要snap拍摄和保存。当然如果保存一份的话,便于下次通过reuse快捷调用。