实验技术
基于共聚焦图像的信号强度分析方法
发布时间:2019年09月17日   作者:Confocal-Admin    阅读次数:607

信号强度分析可对特定组织或细胞上的基因表达强度、Ca离子浓度、PH值等各种生理生化指标的时空变化规律进行量化,属于共聚焦显微镜的高级功能。

虽然共聚焦显微镜软件均自带分析功能,但相关功能模块均只能在插有加密狗的设备机上运行,有些功能还需另行购买,用户在繁忙的设备用机上只做软件分析是不经济的。一般地,用户可基于免费的ImageJ及其插件,配合共聚焦分发版软件实现几乎所有的分析功能。

本平台共聚焦显微镜产生的原始数据文件在用户自己的电脑上只能实现图像导出和简单编辑功能,若要实现信号强度分析等高级功能,需要先从设备专有格式的图像文件中分解出tiff格式的灰度图,然后导入ImageJ进行分析。下面简介一下用户在自己电脑上进行图像分析的方法。


例一: FV3000拍摄的拟南芥根尖纵截面,目标细胞中GFP信号强度分析

1、将拷回的oir文件用FV31S-SW打开,然后选择Export,SaveAsType选tiff,OutputFormat选RawDateExtracted 16bit进行导出

2、打开ImageJ,用File>Open打开刚才导出的文件,用圈选工具圈选目标细胞,然后 用Analyze>Measure计算圈选区域的信号平均强度


例二:FV3000拍摄的同一视野分别用488和405激发成像的两张图上的某个细胞进行信号强度分析

1、将拷回的2个oir文件用FV31S-SW打开,然后选择Export,SaveAsType选tiff,OutputFormat选RawDateExtracted 16bit分别导出

2、用Zen2009打开上述两个tiff文件,选择图1,然后在processing窗口选择CopyChannel功能,然后单击InputImage右边的Select按钮

3、选择图2,然后单击OutputImage右边的Select按钮,并在下面的Channel列表中选择NewChannel,这样图1就成为双通道合并的多图层文件,另存该文件为tiff格式

4、用ImageJ打开该新生成的tiff文件,对目标区域进行套圈和measure,向右拖图像窗口下部滚动条到第二层,再进行一次measure


例三:FV3000或LSM710拍的图像文件直接进行信号强度分析

1、打开ImageJ,用File>Open直接打开oir或LSM格式的原始文件,第一屏Bio-fromats import Option窗口中点OK键确认,然后在打开的图像窗口中进行套圈分析

2、若不出现Bio-fromats import Option窗口,请先通过help>update...更新Bio-formats软件包或更新全部


软件用途归纳如下:

软件名
通常用途 特殊用途 操作流程
LSM710配套软件 ZEN2009
查看和编辑图像亮度,导出24位真彩色图像 导出tiff,图层、通道的组合和拆分 通过processing>copy channel将拟追加图像作为新通道添加到当前图像上一起分析
FV3000配套软件 FV31S-SW
查看和编辑图像亮度导出24位真彩色图像
按8位或16位色深导出某个通道的信号为单色tiff文件 在导出窗口,选择格式为纯tiff,输出格式选RawData,得到16位色深数据的原始图像文件
ImageJ 图像分析,信号强度计算和分析

直接打开共聚焦原始图像或tiff图,进行信号强度分析

手工或基于阈值自动分析出ROI,进行强度计算或分析